Для life science тритий является самым востребованным и удобным радионуклидом по нескольким соображениям. Во-первых, практически любую органическую молекулу можно пометить тритием (лишь бы содержала водород). Во-вторых, тритий легко вводится в разные соединения, и химия этих процессов разработана лучше, чем для любого другого радионуклида. В-третьих, тритий -- это самый дешевый радионуклид, из используемых в life science. Есть прекрасная подробная монография по синтезу соединений, меченных тритием, (В.П. Шевченко, И.Ю. Нагаев, Н.Ф. Мясоедов, "Меченные тритием липофильные соединения" Москва, изд. "Наука" 2003г.), поэтому я только кратко перечислю основные методы получения 3Н-соединений.

28. Химический синтез гидрированием 3Н2 ненасыщенных связей, дегалоидирование и восстановление гидроксильных или карбонильных соединений.

29. Каталитический или термоактивированный водородный обмен.

30. Модификация соединений с помощью 3Н-метильных или 3Н-ацетильных групп.

31. Гидрирование Li[B3H4] или Li[Al3H4]

32. Введение 3Н за счет тритиевой воды (гидролиз или обмен).

33. Ферментативный синтез из 3Н-меченых предшественников.

Можно добавить биосинтез -- выращивание микроорганизмов на среде, содержащей 3Н-предшественник (например, [метил-3H] тимидин, для получения меченой ДНК), с последующим выделением целевого соединения. Однако, этот способ достаточно специфический и обычно применяется только в лабораторной практике для получения биополимеров.

Исторически так сложилось, что меченые тритием компоненты нуклеиновых кислот и аминокислоты стали инструментами для нескольких поколений ученых. Позднее к тритию добавился фосфор-32 (и фосфор-33) для нуклеиновых кислот и сера-35 для белков, и доля работ с тритием в этих направлениях снизилась.

Для исследователей липидов, простагландинов, гормонов, углеводов, антибиотиков, витаминов и многих других классов соединений, тритий -- главный (часто единственно доступный) инструмент повышения чувствительности методов. Это же касается исследований рецепторов, модуляторов и вообще "сигнальных" систем организмов. Поэтому тритий, не имеющий пока особых альтернатив, по-прежнему, остается основным "рабочим" радионуклидом в life science.

Главным недостатком трития является трудность его детекции и количественного измерения из-за слишком "слабого" в-излучения. Наиболее эффективный способ измерения -- жидкостной сцинтилляционый счет, о котором более подробно дана информация в разделе 2.2. Особо следует подчеркнуть, что именно для трития снижение эффективности счета ("гашение") играет существенную роль в количественных измерениях.

Авторадиография тритиевых соединений тоже имеет ряд специфических особенностей. Прямая детекция в-излучения трития фоточувствительным материалом -- процесс очень долгий и используется редко. Зато была предложена оригинальная модификация, согласно которой образец, содержащий тритий, обрабатывается сцинтилляционными веществами, и авторадиография превращается в своеобразную "автофлюорографию". Для пластин ТСХ -- это опрыскивание раствором РРО, который уже упоминался в разделе "жидкостной сцинтилляционный счет". После высушивания такая пластинка экспонируется с рентгеновской плёнкой, и далее -- как обычно.

Для ПААГ предложена процедура пропитки геля тем же РРО. Сначала приходится заместить воду в геле на диметилсульфоксид (DMSO), т.к. РРО нерастворим в воде. Затем гель пропитывают раствором РРО в DMSO, после чего обратно замещают DMSO на воду (РРО выпадает в геле в осадок и гель становиться белым). После всех этих процедур гель высушивают и экспонируют с рентгеновской пленкой. "Занудность" этих операций окупается сторицей -- получается возможность детекции продуктов, меченных тритием, (например пептидов, меченных 3Н-лейцином) сразу после электрофореза в ПААГ.

Еще одна "деликатная" сторона использования соединений, меченных тритием, -- это химическая стабильность таких соединений. Как ни странно на первый взгляд, но радиолиз -- химическое разрушение молекул под действием ионизирующего излучения -- именно для соединений трития играет весьма существенную роль. Это важно помнить, т.к. большой период полураспада (12 лет) якобы позволяет использовать синтезированные вещества в течение месяцев ( а иногда и лет) с момента паспортизации. Здесь надо быть очень осторожным, т.к. часто при неправильных условиях хранения вместо целевого соединения остается сложнейшая смесь продуктов радиолиза, где нужного соединения не более трети. Типичная ошибка -- хранение водного раствора тритиевого соединения в замороженном виде. В замороженном виде высокомеченные тритием соединения "рассыпаются" гораздо быстрее, чем в растворе. Поэтому для длительного хранения меченых тритием соединений при -20°С обязательно добавляют спирт или другой "антифриз", препятствующий замерзанию раствора.

С химической стабильностью соединений трития связана еще одна проблема. Устойчивость химической связи водорода (любого изотопа водорода) с другими атомами в молекуле зависит от природы этой связи. Соответственно, возможность обмена водорода в молекуле меченого соединения с растворителем, например с водой, обязательно надо учитывать. Водород карбоксильной группы в воде за счет электролитической диссоциации обменивается мгновенно, а водород в алкильном или арильном фрагменте молекулы обменивается очень трудно -- при нормальных условиях обмена нет. Между этими "крайними" примерами находится огромное многообразие молекул с разной способностью к "водородному обмену", и для разных биохимических процессов вопрос о стабильности тритиевой метки может быть или чрезвычайно актуальным или совершенно несущественным.

7. Радионуклид 14C

Радионуклид 14C получают облучением нитрида алюминия по реакции:

14N + 0n --> 14C + 1p

в виде 14C-карбида. Из него 14C выделяют в виде 14CО2, который обычно поглощают Ba(OH)2, и полученный 14C-карбонат является основным радиоактивным сырьем для всех синтезов 14C-соединений. Всё обилие 14C-меченых соединений в каталогах разных фирм-производителей синтезируется двумя путями:

34. Биосинтез. В питательную среду к микроорганизмам (обычно это водоросли типа хлореллы) добавляют 14CО2 в качестве единственного источника углерода. После выращивания из биомассы выделяют равномерно меченые 14C-соединения. Таким путем получают аминокислоты, нуклеозиды, сахара, липидные компоненты и другие природные соединения. Иногда 14C-биомассу водорослей используют как источник углерода (своего рода меченый пептон) для выращивания штамма-продуцента какого-нибудь важного соединений.

35. Химический синтез. Синтез всего многообразия органических веществ из карбоната -- классическая задача органической химии. Знаменитые цепочки превращений органических соединений (кошмар многих поколений студентов и школьников) в полной мере реализованы в синтезе 14C-соединений. Все органические соединения, которые не удается получить биосинтезом, синтезируют химически.

Схема распада углерода-14: 14C --> 14N + e. Хотя с детекцией 14C особых проблем не возникает, применение 14C-соединений в life science крайне ограничено. Это связано с очень низкой молярной активностью 14C-соединений, и даже кратно меченые молекулы не меняют ситуацию радикально. Обычно молярная активность 14C-соединений не превышает 20ч50 мКи/ммоль, (у соединений трития почти в 1000 раз выше, а у фосфора-32 или 33 еще в 100 раз выше) и, следовательно, по чувствительности методы с использованием 14C-соединений значительно уступают методам, в которых используют 3Н-соединения. На сегодняшний день 14C-соединения прочно удерживают за собой только одну "нишу" в life science -- это изучение метаболизма новых лекарственных (или косметических) препаратов. Для изучения деградации, накопления в органах, скорости и путей выведения, биодоступности и прочих аспектов метаболизма равномерно меченые 14C-соединения остаются востребованными, несмотря на очень высокую стоимость и трудоемкость синтеза.

8. Радионуклиды 32P и 33P

Радионуклиды 32P и 33P -- очень удобны для life science, но их применение ограничено природой, т.к. фосфор в природных органических соединениях присутствует гораздо реже, чем водород, углерод или кислород.

Получение радиоактивных изотопов фосфора (32Р и 33Р) с технической точки зрения одинаково: облучение элементарной серы особой чистоты в ядерном реакторе.

Однако, с экономической точки зрения разница колоссальная. Дело в том, что 32Р получают по реакции 32S + 0n --> 32P + 1p в виде 32P-ортофосфата. Стартовый материал мишени -- природная элементарная сера, содержащая более 92% стабильного изотопа 32S. Изотоп 33Р получают по реакции 33S + 0n --> 33P + 1p также в виде 33P-ортофосфата. Но мишенью для этой реакции служит изотоп 33S, содержание которого в природе составляет доли процента. Для получения 33Р высокого качества необходимо использовать для облучения только 33S с обогащением не ниже 98,5ч99,0%. Это сразу существенно увеличивает стоимость продукта, т.к. стоимость обогащенной серы-33 больше природной серы примерно на 6 порядков (в миллион раз). Поэтому соединения фосфора-33 всегда будут дороже аналогичных соединений, меченных фосфором-32.

Схемы распада радионуклидов фосфора : 32P --> 32S + e и 33P --> 33S + e

Исходным радиоактивным сырьем для получения соединений, меченных радиоактивными изотопами фосфора, всегда является ортофосфорная кислота (32Р или 33Р соответственно). Так как химия и биохимия 32Р и 33Р абсолютно одинаковы, в дальнейшем речь пойдет о фосфоре-32, с учетом того, что все это распространяется и на фосфор-33. В особых случаях, когда необходимо, будут отмечаться различия. Собственно сама 32Р-орто-фосфорная кислота в life science используется редко. Обычно это выращивание микроорганизмов (бактерий или дрожжей) или культуры клеток в среде, содержащей 32Р-ортофосфат. Полученную меченую биомассу отделяют от культуральной жидкости, а затем исследуют. Несколько замечаний по этому процессу.

36. Исходная 32Р-ортофосфорная кислота без носителя (этот термин означает, что в препарат не добавляли специально нерадиоактивную ортофосфорную кислоту) имеет молярную активность не менее 5000 Ки/ммоль, и, соответственно, концентрация собственно фосфата в среде только за счет радиоактивного фосфора будет не выше 10-8 М. Для биологических (микробиологических) работ такая концентрация фосфата в среде слишком низкая -- клетки будут "считать", что фосфора нет вообще. Поэтому в культуральную среду обязательно добавляется "холодный" фосфат в концентрации, необходимой для усваивания. Обычно это не ниже 10-4 М. Не пытайтесь "включить" радиоактивный фосфат в культуру клеток без "холодного" носителя. Часть радиоактивного фосфата просто сорбируется на поверхности посуды или клеток, а включения в клеточный обмен не произойдет.

37. Оптимальная концентрация фосфата для таких экспериментов подбирается индивидуально для разных задач и видов клеток. "Переносить" данные по оптимальной концентрации с одного вида экспериментов (или клеток) на другой надо осторожно.

Основными соединениями фосфора-32, применяемыми в life science, являются нуклеозид-5'-трифосфаты, меченные в альфа или гамма положении. В конце 60-х -- начале 80-х годов ХХ века было разработано несколько способов синтеза этих соединений, но после работы Джонсона и Валсеса, предложенный ими ферментативный способ стал рутиной как для лабораторного синтеза, так и для масштабного производства. Химические методы синтеза меченных фосфором-32 соединений используются, когда нет ферментативного пути, например для синтеза синтетических аналогов нуклеотидов.

Измерение активности радионуклидов 32Р и 33Р -- операция достаточно простая -- любой жидкостной сцинтилляционный в-счетчик считает 32Р и 33Р с эффективностью не ниже 90%. Для фосфора-32 использование сцинтиллятора совсем не обязательно. Обычно измерение фосфора-32 проводят за счет "свечения Черенкова" -- эффекта, обусловленного взаимодействием высокоэнергетических электронов с окружающей средой. Не вдаваясь в физические аспекты Черенковского свечения, следует знать, что сцинтилляционные счетчики "считают" фосфор-32 без всякого сцинтиллятора с эффективностью около 30%. Черенковское свечение фосфора-32 можно легко увидеть. Нанесите на подложку (пластинку ТСХ или фильтровальную бумагу) 1 мкл раствора 32Р-ортофосфорной кислоты (или любого другого соединения фосфора-32) с активностью 50 мкКи (около 2МБк) и поместите подложку между плоскостями двух кусков обычного стекла, толщиной 4ч5 мм. В темноте (только без "красного" света) через 3ч5 мин. адаптации глаза будет хорошо видно зеленовато-голубое свечение пятна, соответствующего точке нанесения раствора на подложку. Не подносите такой источник близко к глазам -- все прекрасно видно с расстояния 40ч60 см.

Весьма полезным для работы является возможность измерения фосфора-32 прямо в пластиковых пробирках, помещенных в стандартный сцинтилляционный флакон. На практике это означает, что вы можете измерять активность своего образца, например, вырезанный кусок из агарозного геля или пробирку с фракцией элюата хроматографического разделения, а затем использовать образец для дальнейшей работы. Такая особенность фосфора-32 является его важнейшим преимуществом перед другими в-радионуклидами, применяемыми в life science. Все остальные в-радионуклиды, приведенные выше в таблице 1, включая фосфор-33, требуют для измерения в сцинтилляционном счетчике прямого контакта с сцинтилляционной жидкостью, т.е. добавления образца прямо во флакон, содержащий сцинтиллятор. Естественно, после этого образец для дальнейшей работы теряется.

Среди радионуклидов, применяемых в life science, фосфор-32 является "рекордсменом" по чувствительности методик с его использованием. Однако, простой расчет чувствительности метода (поделите обычный предел обнаружения фосфора-32, т.е. около 3ч4 Бк, на максимальную молярную активность используемого соединения, т.е. около 2х1017 Бк/моль) показывает величину около 10-17 моля. К сожалению, это неправильно. Причина этого в высоком "биологическом" фоне. Например, при постановке ДНК-полимеразной реакции контрольная проба, в которую добавляют все компоненты реакции кроме фермента, также показывает некоторое "включение" радиоактивного фосфора в ДНК, на самом деле обусловленное просто неспецифической сорбцией радиоактивного предшественника биосинтеза. Такая неспецифическая сорбция есть всегда в любом биохимическом эксперименте и фактически чувствительность метода будет определяться величиной этого "биологического" фона. Например, в реакцию добавлено 0,1 МБк [б-32P] dNТР (это примерно 2х106 срм по Черенкову), ферментативое включение в ДНК около 30%, а неспецифическая сорбция -- фон -- составляет около 0,1%, т.е. 2х103 срм. Граница достоверности определяемой величины будет определяться именно неспецифической сорбцией (в этом примере 2х103 срм), которая обычно гораздо выше фона измерительной аппаратуры. В этом примере фон 2000 срм, и, следовательно, достоверная величина измеряемого эффекта должна быть не ниже 6000 срм, что в 30 раз снижает чувствительность по сравнению с "идеальной" расчетной.

Использование фофора-32, а позднее и фосфора-33, начиналось еще в 50-х годах ХХ века, однако после разработки методов секвенирования ДНК с помощью фосфора-32 спрос на соединения, меченные фосфором-32, достиг просто огромных величин. В "пике" потребления нуклеотиды, меченные фосфором-32, производились в мире в объеме несколько десятков кюри ежемесячно (это десятки тысяч фасовок каждый месяц), и только флюоресцентные методы секвенирования спустили потребление радиоактивного фосфора с заоблачных высот к нынешнему состоянию.

Традиционно меченые фосфором нуклеотиды используются по нескольким направлениям:

38. Введение в ДНК (РНК) за счет нуклеозид-5' -- [б-32Р]-трифосфатов и изучение соответствующих ферментов.

39. Введение в олигонуклеотиды 32Р фосфорилированием 5'-конца с помощью [г-32P] ATP и полинуклеотидкиназы.

40. Фосфорилирование белков протеинкиназами с помощью [г-32P] ATP.

Наиболее востребованным меченым соединением фосфора-32 является аденозин-5'-[г-32P] трифосфат, который обычно сокращенно обозначают [г-32P] АТР. Это вполне объяснимо, т.к. кроме широко известной методики введения 32Р-метки на 5'-конец олигонуклеотида с помощью Т4 полинуклеотидкиназы, [г-32P] АТР используют для изучения различных фосфотрансфераз (киназ), в том числе и для биоскрининга химических библиотек протеин-киназными тестами. Нуклеозид-5'трифосфаты, меченные фосфором-32 в б-положении, сокращенно обозначают [б-32Р] NТР или [б-32Р] dNТР (рибо- или 2'-дезоксирибонуклеотиды соответственно) и используют, в основном, для введения "метки" в нуклеиновые кислоты с помощью РНК- или ДНК-полимераз. Естественно, сюда же примыкают исследования биосинтеза нуклеиновых кислот и их ферментативного аппарата. Технология введения 32Р-метки в нуклеиновые кислоты подробно изложена в "классике методов" ( Маниатис Т. Фрич Э. Самбрук Дж. "Молекулярное клонирование" М. "Мир" 1984 г.). Поэтому я отмечу только некоторые характерные для начинающих ошибки.

Вполне естественное стремление каждого исследователя получить меченый препарат ДНК (например ДНК-зонд для гибридизации) с максимальной удельной активностью имеет свои ограничения. Считается, что препарат ДНК, имеющий удельную активность не менее 108 срм на мкг ДНК, "пометился" хорошо и может дать при гибридизации чувствительность, близкую к максимальной. Если удельная активность препарата 107ч108 срм на мкг ДНК, то результат получится весьма посредственный, а если синтезированный вами препарат имеет удельную 106 срм на мкг ДНК, то вы что-то сделали неправильно -- такой препарат к работе мало пригоден.

Еще одна характерная ошибка начинающих исследователей -- попытка синтеза высокомеченного ДНК-зонда с помощью замены нерадиоактивных dNTP на [б-32Р] dNТР. К сожалению, попытки использовать для синтеза меченой ДНК 2ч3, а иногда и всех 4-х меченых [б-32Р] dNТР вместо одного, заранее обречены. В лучшем случае использование двух меченых [б-32Р] dNТР даст почти такой же результат (как правило, все-таки немного ниже) как использование одного [б-32Р] dNТР. В остальных вариантах, независимо от конкретных нуклеотидов, удельная активность такой 32Р-ДНК будет существенно ниже. Это обусловлено двумя причинами. Во-первых, оптимальная концентрация dNTP для синтеза меченой ДНК не ниже 10 мкМ (часто делают ещё выше), а молярная концентрация меченого [б-32Р] dNТР в реакции -- примерно 0,2ч0,4 мкМ. Замена "холодного" dNTP на [б-32Р] dNТР снижает концентрацию в 20ч40 раз. Следовательно, замена всех dNTP на радиоактивные [б-32Р] dNТР снижает концентрацию всех предшественников биосинтеза до величин ниже Км (константы Михаэлиса) для каждого dNТР, что в данном случае почти останавливает реакцию. Во-вторых, химическая чистота "холодных" dNTP, как правило, выше [б-32Р] dNТР и, соответственно, количество примесей, способных ингибировать ДНК-полимеразу, возрастает, если заменять все dNTP на соответствующие [б-32Р] dNТР.

Аналогичная ситуация наблюдается и при использовании [б-32Р] NТР в синтезе РНК. Так как величина Км большинства РНК-полимераз находится в интервале 10ч100 мкМ, то использовать [б-32Р] NТР без добавления в реакцию "холодного" трифосфата до приемлемой концентрации бессмысленно -- реакция не идет. Более того, РНК-полимеразы более "капризны", чем ДНК-полимеразы, и требования к химической чистоте всех ингредиентов, в том числе и меченых предшественников биосинтеза РНК, еще более жесткие.

Все фирмы-производители нуклеозид-5'трифосфатов, меченых фосфором-32 (или 33), поставляют эти соединения с добавками, снижающими химическую деструкцию веществ, обусловленную воздействием ионизирующего излучения, и в криостатах с сухим льдом (при -70°С). Такие добавки, "продлевающие" жизнь меченым соединениям, получили название радиопротекторов -- по аналогии с веществами, снижающими вредное воздействие ионизирующего излучения на живые организмы. Каждый производитель использует свои, как правило, запатентованные радиопротекторы, продлевающие сроки использования меченых препаратов. Часто такие радиопротекторы (или их комбинации) окрашены в яркие цвета, что создает определенное удобство для работы -- хорошо видно даже минимальный объем окрашенного меченого соединения. Естественно, что важнейшее требование к радиопротектору для меченых соединений в life science -- это нетоксичность или "безвредность" самого радиопротектора и продуктов его радиолиза для тех биологических и ферментативных систем, в которых используется данный меченый препарат. Иными словами, радиопротектор не должен участвовать в биологическом процессе, который вы собираетесь изучать с помощью меченого соединения, содержащего радиопротектор. Соединения, меченные фосфором-32 или фосфором-33, которые производили и производят в России, окрашены за счет радиопротектора в ярко-красный цвет. При длительном хранении цвет будет "желтеть". Пожелтевший препарат лучше выбросить сразу -- весь радиопротектор в таком препарате уже разрушился, и ничего хорошего от его радиоактивных остатков ждать не следует.

Вообще, саморадиолиз соединений, меченных фосфором-32 или фосфором-33, очень неудобное для работы явление, и его надо учитывать. Без радиопротекторов меченные фосфором-32 соединения в концентрированном растворе (более 15 мКи/мл) могут храниться очень недолго, а в сухом виде оставлять их дольше нескольких часов не следует, т.к. скорость химических превращений, под действием ионизирующего излучения в этом случае очень высокая.

Основное отличие фосфора-33 от фосфора-32 заключается в энергии в-излучения этих радионуклидов, т.к. различие в периоде полураспада менее чем в 2 раза несущественно. При этом преимущество более слабого излучения фосфора-33 (кроме психологического комфорта) проявляется только при необходимости авторадиографии с высоким разрешением близко расположенных меченых продуктов, например, автограф геля после электрофоретического разделения меченых фрагментов нуклеиовых кислот. Действительно, эффективность "ручного радиоактивного" сиквенса определялась разрешающей способностью электрофоретического разделения продуктов реакции терминации синтеза ДНК (в методе Сэнгера) или фрагментов химического расщепления [5'-32P]-одноцепочечной ДНК (по Максаму-Гилберту). Для 32Р-меченых фрагментов с одного геля квалифицированный специалист мог "прочитать" 350ч400 нуклеотидов. "Зубры" секвенирования ДНК в Москве и Новосибирске довели эту величину до 700 нуклеотидов. Однажды, автору этого обзора в новосибирском Академгородке с гордостью продемонстрировали автограф геля, с которого удалось "прочитать" почти 750 нуклеотидов. В научном фольклоре встречались даже более высокие величины (вплоть до 1000), однако, таких задокументированных результатов я не встречал. Переход на фосфор-33 только за счет более мягкого в-излучения сразу увеличивал разрешение в 1,5ч2 раза и, следовательно, повышал производительность труда при сиквенировании ДНК. Впрочем, автоматические секвенаторы ДНК, использующие флюоресцентную метку, полностью прекратили эту гонку за производительностью "ручного сиквенса" с использованием радиоактивных изотопов.

9. Радионуклид 35S

Наработка радионуклида серы-35 проводится в ректоре облучением KCl или NaCl по реакции 35Cl + 0n --> 35S + 1p в виде 35S-сульфата. Некоторые специфические методики приготовления образцов KCl для облучения позволяют получать 35S в виде элементарной серы. Схема распада серы-35: 35S --> 35Cl + e . Удобный период полураспада и вполне приемлемая энергия в-излучения делают серу-35 очень популярным радионуклидом в своей "нише", вызывая досаду малой распространённостью соединений серы в живых организмах.

В life science сера-35 используется, в основном, для введения "метки" в белок за счет 35S-метионина или (реже) 35S-цистеина. Аминокислоты, меченные серой-35, получают биосинтезом, выращивая бактериальную биомассу на среде, содержащей 35S-сульфат. После кислотного гидролиза 35S-биомассы из белкового гидролизата выделяют аминокислоты. Иногда фирмы-производители вместо индивидуальных 35S-аминокислот предлагают просто 35S-белковый гидролизат, который может быть использован для выращивания культуры клеток в 35S питательной среде.

В 80-х годах ХХ-века на пике бума секвенирования ДНК с помощью радиоактивных изотопов фирма Амершам предложила использовать вместо нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 (или 33), нуклеозид-5'-трифосфаты, меченные серой-35 по фосфатной группе, т.е. 35S- тиофосфаты. Однако, несмотря на широкую рекламу, большого распространения этот вариант секвенирования ДНК так и не получил. Во-первых, работа с радиоизотопами фосфора была привычней, а при массовой работе и регулярных поставках "свежей метки" надежней. Во-вторых, появившиеся вскоре флюоресцентные автоматические секвенаторы сделали это направление просто ненужным. Тем не менее, в арсенале life science остались нуклеозид-5' - [г-35S] тиотрифосфаты и нуклеозид-5' - [б-35S] тиотрифосфаты для решения специальных задач, например, энзимологии протеинкиназ или энзимологии биосинтеза (деградации, коррекции) нуклеиновых кислот.

Главным недостатком соединений, меченных серой-35, которые используются в life science, является их низкая химическая стабильность. При том, что процессы радиолиза для этих соединений менее критичны, чем для трития или фосфора-32, 35S аминокислоты и тиотрифосфаты легко окисляются, поэтому их важно хранить при -20°С (лучше -70°С) и контролировать чистоту перед использованием.

10. Радионуклид 125I

Среди радиоактивных изотопов йода самым популярным для исследовательских работ в life science является 125I. Это реакторный изотоп, получающийся из стабильного изотопа ксенон-124. Среди радионуклидов в таблице, приведенной в разделе 4, йод-125 единственный г-излучатель, хотя тип распада (точнее ядерного превращения) -- электронный захват, в результате которого йод превращается в теллур с выделением г-кванта. Йод-125 -- очень удобный для детекции радионуклид. Во-первых, его можно измерять сцинтилляционным г-счетчиком (не путайте с жидкостным сцинтилляционным в-счетчиком), и весь радиоиммуноанализ в пробирочном варианте был построен на этих измерениях. Во-вторых, йод-125 прекрасно детектируется авторадиографически на рентгеновской пленке или "электронной авторадиографией" с помощью имиджера. Наконец, йод-125 можно измерять на жидкостном сцинтилляционном в-счетчике во флаконе с сцинтиллятором, как тритиевый образец, за счет электронов Оже.

Несмотря на широкое применение йода-125 в life science, собственно 125I-меченные соединения почти не используются. Правильнее говорить об использовании йода-125 для "мечения" биологических макромолекул, т.е. получения меченых соединений второй группы -- модифицированных соединений (см. раздел 3). Поэтому самым востребованным соединением йода-125 в life science является раствор йодистого калия -- K125I -- исходный материал для введения радионуклида в нужную молекулу.

Основным "потребителем" йода-125 являются исследования белков и пептидов. Традиционно йодирование белков проводят в нейтральной или слабокислой среде в присутствии окислителя, который окисляет йодид, обеспечивая его реакцию с аминокислотными остатками белка. Легче всего йод присоединяется по остаткам тирозина и гораздо хуже -- по остаткам фенилаланина, триптофана или гистидина. Йодированный тирозиновый остаток практически не меняет физико-химические и иммунологические свойства белка, что очень важно для дальнейшего использования меченого препарата. В качестве окислителя использовались самые различные агенты: хлорамин Т, "йодоген", перекись водорода с лактопероксидазой и даже катод полярографа (при электрохимическом окислении). Каждый метод имеет свои особенности, но общий недостаток для всех -- это окисление, которое для многих белков приводит к потере (или изменениям) ими своих свойств и функций. Даже кратковременное воздействие окислителя (реакция с хлорамином Т длится обычно 30ч40 сек.) для многих белков недопустимо. Поэтому был предложен реагент Болтона-Хантера -- реагент, ацилирующий свободные аминогруппы белков. Такая модификация белка проходит без окисления, однако ацилирование аминогруппы меняет физико-химические характеристики исходного белка и может значительно изменить его иммунологические свойства. Особенно это касается небольших молекул, например, пептидов, где количество антигенных детерминант ограничено размерами самой молекулы.

Тем не менее, йодирование белков и пептидов йодом-125 широко используется для различных исследований, особенно иммунологических, рецепторных, гормональных и др. Такие 125I-меченные пептиды также используются для исследований, связанных с распределением пептидов по органам и тканям экспериментальных животных и их фармакокинетике.

Были предприняты попытки использовать 125I для исследований нуклеиновых кислот. Действительно, можно "пройодировать" ДНК, используя хлорид таллия и K125I, для введения "метки" по остаткам цитидина (образуется 5-йодцитидин). Можно вводить 125I в ДНК за счет ферментативного синтеза, используя ДНК-полимеразу и [5-125I] цитидин-5' трифосфат - 125I-аналог dCTP. Тем не менее, широкого распространения эти методики не получили, так как особых преимуществ у 125I перед 32Р нет. Кроме того, высокомеченная 125I ДНК гораздо быстрее деградирует под действием продуктов радиолиза и электронов Оже, чем ДНК, меченная фосфором-32 или фосфором-33.

11. Основы радиационной безопасности

Всем, кто работает с источниками ионизирующего излучения, в том числе с радиоактивными веществами, приходится получать допуск к работе: проходить медкомиссию и сдавать экзамен по знанию норм и правил радиационной безопасности. Возможно, самым ярким примером тесного переплетения фундаментальных академических исследований и утилитарно-прикладных разработок являются правила работы с источниками ионизирующего излучения. Вся информация для проведения работ с радиоактивными веществами изложена в двух основных документах: "Нормы радиационной безопасности" (НРБ) и "Основные санитарные правила" (ОСП). Эти скучные строгие документы существуют уже более 30-ти лет. Регулярно (примерно раз в 10 лет) информация в этих документах обновляется в соответствии с развитием радиобиологических и биофизических исследований, вносятся изменения, иногда весьма серьезные, но общая структура документов не меняется. НРБ устанавливает нормативы по всем параметрам, связанным с радиоактивностью: дозы и уровни облучения, содержание различных радионуклидов в воде, воздухе и т.д., уровни загрязнения радионуклидами и пр. Следует подчеркнуть, что это не военно-технический или медико-терапевтический документ, а общие нормы, установленные для всех организаций и лиц, постоянно работающих с источниками ионизирующего излучения, в том числе с радиоактивными веществами.

Хотя в НРБ и ОСП даны кратко определения основных терминов и понятий, ниже я попытаюсь упрощенно систематизировать эту информацию для начинающих работать с радиоактивными веществами.

Экспозиционная доза -- энергетическая характеристика г- и рентгеновского излучения, которая оценивается по эффекту ионизации сухого атмосферного воздуха. Единица экспозиционной дозы рентген - поток г- или рентгеновского излучения, который в 1 см3 сухого воздуха образует 2х109 пар ионов. Эта самая популярная единица измерения в дозиметрии, хотя и является устаревшей и внесистемной.

Поглощенная доза -- собственно это и является характеристикой опасности излучения, так как определяется как отношение поглощенной энергии ионизирующего излучения к массе облученного вещества. Единицы поглощенной дозы -- рад и грей. Рад -- это внесистемная (но популярная) единица -- rad (radiation absorbed dose) -- равна 100 эрг/г. Грей -- единица в системе СИ, равная 1 дж/кг. Значит, 1 Гр (грей) равен 100 рад.

Эквивалентная доза -- произведение поглощенной дозы излучения на некий коэффициент качества излучения, учитывающий неблагоприятные биологические последствия. Единицы измерения -- бэр и зиверт. Бэр - биологический эквивалент рентгена (иногда говорят рада) -- доза любого вида ионизирующего излучения, производящая такое же воздействие на биологические объекты как доза г- или рентгеновского излучения в 1 Р (рентген). В системе СИ принят зиверт -- эквивалентная доза, соответствующая поглощенной доза в 1 Гр (грей) с коэффициентом качества 1.

Эффективная доза -- величина, используемая для оценки меры риска возникновения отдаленных последствий облучения всего тела человека и его отдельных органов и тканей с учетом их радиочувствительности.

Вся эта "голубая муть" на дозовую тему для нормальной работы, конечно, не нужна. Тем более для работы в life science. Дозиметрические приборы (точнее, приборы радиометрического контроля) меряют или мощность экспозиционной дозы г- или рентгеновского излучения (в миллирентгенах в час), или поток в-частиц с поверхности (количество частиц в сек. на 1 см2). Собственно поглощенная работником доза обычно измеряется специальными индивидуальными дозиметрами разных систем: ионизационными -- типа ДП-22В, фотокасетными (количественная авторадиография) и даже современными термолюминисцентными. Однако, все замеры всеми типами дозиметров всегда показывали, что для работающих в life science, поглощенные дозы бесконечно малы и не могут быть достоверно измеряны существующими приборами.

Порядок работы с радиоактивными веществами определен в ОСП. Последняя редакция этого документа называется "Основные санитарные правила обеспечения радиационной безопасности" (ОСПОРБ-99), и название полностью соответствует содержанию. В ОСПОРБ-99 не только подробно изложен порядок работы с любыми радионуклидами, но и порядок их получения (передачи) от других организации, порядок списания источников и сдачи радиоактивных отходов и многое другое. Согласно классификации работ с радиоактивными веществами в этом документе в зависимости от уровня опасности, все исследования с радиоактивными изотопами в life science относятся к третьему (самому низкому) классу радиационной опасности. Эта "классность" работ определяется, во-первых, количеством радионуклида на рабочем месте, а во-вторых, "радиотоксичностью" радионуклида и характером работ по его использованию. Радиотоксичность -- понятие, введенное для оценки вреда, который может нанести радионуклид человеку, и зависит от типа распада, энергии излучения, периода полураспада и способности радионуклида усваиваться организмом. Все радионуклиды разбиты на четыре группы радиотоксичности: А (самая опасная), Б, В, и Г (наименее опасная). Из радионуклидов, указанных в таблице 1, самым "вредным" является фосфор-32 -- группа Б.

Опасность радионуклида при внешнем облучении определяется характером и энергией излучения. Для всех "мягких" в-излучателей (для life science радионуклидов из таблицы 1: тритий, углеров-14, фосфор-33, и сера-35) опасность минимальна. Электронный поток задерживается листом плотной бумаги, резиновыми хирургическими перчатками и т.д. Сложнее с фосфором-32. Кроме излучения высоко энергетических электронов для фосфора-32 характерно "тормозное излучение" -- вторичное электромагнитное излучение, возникающее при торможении электрона в плотной среде. По своей природе такое тормозное излучение одинаково с рентгеновским и его проникающая способность очень высокая. Именно по этой причине для защиты от излучения фосфора-32 применяются дополнительны средства защиты: защитные экраны со свинцовыми стеклами и свинцовые контейнеры для препаратов. Аналогичная защита требуется и для работы с йодом-125. Гамма-излучение 125I экранировать легкой защитой из оргстекла не удается.

Существуют три защитных фактора от воздействия ионизирующего излучения на организм.

41. Расстояние. Чем дальше вы от источника излучения, тем лучше. Это не только вывод народной мудрости -- "держаться подальше", но и научно обоснованная реальность, т.к. интенсивность излучения убывает пропорционально квадрату расстояния. Поэтому старайтесь не брать радиоактивные препараты руками (даже в перчатках), а пользуйтесь пинцетами, захватами и прочими дистанционными приспособлениями, если такая возможность есть.

42. Время. Чем меньше время контакта с радиоактивным веществом, тем меньше вред воздействия. Поэтому готовьте заранее все реактивы, приборы, расчеты и продумывайте свои действия, чтобы сократить время непосредственного контакта с радиоактивным веществом до минимального.

43. Защитная среда (экранирование). Собственно защита с помощью различных контейнеров, стенок, экранов, защитной спецодежды, очков и т.д. Почему-то этому фактору уделяют самое большое внимание, хотя первый и второй гораздо важнее и проще.

Несколько сложнее ситуация с внутренним облучением. Понятно, что внутреннее облучение возможно только при попадании радионуклида вовнутрь вместе с пищей, водой или при вдохе. Так как такое попадание обычно не планируется, то и оценить количество радиоактивного материала и, соответственно, дозу внутреннего облучения очень сложно. Особенно это проблематично для слабых в-излучателей трития или углерода-14. Поэтому главным способом снижения внутреннего облучения персонала, работающего с радионуклидами, является аккуратность в работе с открытыми источниками и соблюдение санитарных и гигиенических норм и правил.

Вообще, вопреки разным слухам, количество радиоактивного материала, которое используется для life science, не может нанести серьезного ущерба для здоровья человека, работающего непосредственно с препаратом, и тем более для его будущих детей. Даже если в полном безумии кто-то проглотит 1ч2 полных фасовки [г-32P] ATP (40 МБк), то ущерб будет выражаться, как материальные потери от нецелевого использования препарата, но не от физического вреда здоровью проглотившего. За многолетнюю работу многочисленных научных сотрудников в биологических НИИ в СССР, а затем в России, не зафиксировано ни одного случая отрицательного воздействия радиоактивных препаратов на здоровье работающего сотрудника. Слишком маленькие количества радиоактивных препаратов применяют для работы по III-му классу работ с радиоактивными веществами. Однако, это не относится к работам на предприятиях, производящих радионуклиды, и к другим организациям, где работают с радионуклидами по I или II классу работ.

Array

Страницы: 1, 2